นโยบายการจัดการความรู้ มหาวิทยาลัยสงขลานครินทร์ 1.ให้ใช้เครื่องมือการจัดการความรู้ผลักดัน คุณภาพคน และกระบวนทำงาน 2.ส่งเสริมการแลกเปลี่ยนประสบการณ์การทำงาน จากหน้างาน 3.ส่งเสริมให้มีเวทีเรียนรู้ร่วมกัน

อั้ม
Ico64
ความเคลื่อนไหวล่าสุด
  • ไม่มี
เครือข่าย
สมาชิก · ติดตาม: 0 · ผู้ติดตาม: 0

อ่าน: 2754
ความเห็น: 1

ข้อควรระวังในการเตรียมตัวอย่างโปรตีนสำหรับทำ protein sequence

ข้อควรระวังการเตรียมตัวอย่างโปรตีนสำหรับทำ protein sequence

สำหรับการเตรียมตัวอย่าง เพื่อการถ่ายโอนโปรตีนไปยังแผ่น PVDF

1. การเตรียมตัวอย่างโปรตีนโดยเทคนิค Electrophoresis

เตรียม gel electrophoresis ตามชนิดหรือขนาดของโปรตีนที่ต้องการแยก ข้อควรระวังคือควรมีการไล่ฟองอากาศใน acrylamide solution ที่ใช้เตรียมเจล ก่อนการใช้งาน ทำการแยกตาม Laemmli system และ running gel ที่จะนำมาใช้งานต้องตั้งทิ้งไว้ข้ามคืน หรือทำ pre-electrophorase ก่อนเติม stacking gel

หากเตรียมโดยการใช้ SDS-PAGE ในขั้นตอน Electrophoresis ให้ Pre-run ก่อนการ load ตัวอย่าง และให้ย้อมสีโปรตีนหลังจากที่ blot บน PVDF membrane แล้ว แล้วจึงตัดเฉพาะแถบโปรตีนที่สนใจ ใส่ใน polypropylene หรือ polyethylene tube และจัดส่งทางไปรษณีย์

2. การทำ Electroblotting และย้อมแผ่น PVDF ด้วย 0.1% Coomassie Blue R-250 ใน 50% methanol หลังจากแยกโปรตีนบน electrophoresis gel แล้ว ทำการย้ายโปรตีนจากเจลลงบน PVDF membrane

    • นำ PVDF membrane แช่ใน 100% methanol นานประมาณ 10 วินาที
    • แช่ PVDF membrane และ gel ใน transfer buffer (ประกอบด้วย 25 mM Tris, 192 mM glycine และ 20% (v/v) methanol, pH 8.3) เพื่อทำ gel equlibration
    • วาง filter paper ที่ชุ่มด้วย transfer buffer จำนวน 2-3 แผ่น บน platinum anode ของเครื่อง Trans-Blot SD Semi-Dry Electrophoretic Transfer Cell
    • วาง PVDF membrane ทับบน filter paper
    • วาง equilibrated gel บน PVDF membrane (ทุกขั้นตอนต้องระวังไม่ให้เกิดฟองอากาศ)
    • วาง filter paper ที่ชุ่มด้วย transfer buffer จำนวน 2-3 แผ่น ทับด้านบนสุด
    • วางแผ่น cathode ทับบน filter paper
    • ปิดฝาครอบเครื่อง แล้วต่อสายเข้ากับ power supply (ขั้วในการถ่ายโอนปกติจะเกิดขึ้นในทิศทาง cathode ไปยัง anode) ใช้กระแสไฟ 0.5 แอมแปร์ นานอย่างน้อย 30 นาที ขึ้นกับปริมาณของโปรตีน ขนาดของแถบโปรตีน และความหนาของเจล เป็นต้น
    • ล้างแผ่น PVDF ด้วย Deionized water นาน 5 นาที
    • ย้อมแผ่น PVDF ด้วย 0.1% Coomassie Blue R-250 ใน 50% methanol นาน 5 นาที
    • destrain ด้วย 50% methanol นาน 5-10 นาที ที่อุณหภูมิห้อง (หลีกเลี่ยงการใช้ acetic acid ในการทำ destrain)
    • ล้างแผ่น PVDF ด้วย Deionized water นาน 5-10 นาที ตั้งทิ้งไว้ให้แห้งและเก็บที่ -20 ° C จนกว่าจะใช้งาน
    • ตัดเฉพาะแถบโปรตีนที่สนใจ ใส่ใน polypropylene หรือ polyethylene tube และจัดส่งทางไปรษณีย์ค่ะ
Sections: Miscellaneous
License: สงวนสิทธิ์ทุกประการ Copyright
created: 09 October 2008 09:44 Modified: 21 June 2009 14:39 [ Report Abuse ]
ดอกไม้
People Who Like This
 
Facebook
Twitter
Google

Other Posts By This Blogger

ความเห็น

Ico48
พิทยาธร [IP: 210.246.186.9]
14 July 2009 17:02
#46248

ในขณะที่เราจะทำการ run gel นั้นมีข้อควรระวังเกี่ยวกับ gel อย่างไรบ้าง ถึงจะได้ band ออกมา ใครทราบช่วยบอกทีเพราะว่าทำมาหลาบครั้งแล้วไม่ได้ band เลยสักครั้ง ไม่รู้ว่ามีข้อผิดพลาดตรงไหน ขอบคุณมากสำหรับคำตอบที่ดีน่ะค่ะ

ร่วมแสดงความเห็นในหน้านี้

ชื่อ:
อีเมล:
IP แอดเดรส: 18.234.255.5
ข้อความ:  
เรียกเครื่องมือจัดการข้อความ
   
ยกเลิก หรือ