นโยบายการจัดการความรู้ มหาวิทยาลัยสงขลานครินทร์ 1.ให้ใช้เครื่องมือการจัดการความรู้ผลักดัน คุณภาพคน และกระบวนทำงาน 2.ส่งเสริมการแลกเปลี่ยนประสบการณ์การทำงาน จากหน้างาน 3.ส่งเสริมให้มีเวทีเรียนรู้ร่วมกัน

Zenki
Ico64
นาย พรพจน์ หนูทอง
นักวิทยาศาสตร์
ศูนย์เครื่องมือวิทยาศาสตร์
เครือข่าย
สมาชิก · ติดตาม: 0 · ผู้ติดตาม: 2

อ่าน: 633
ความเห็น: 0

CLEM: เตรียมตัวอย่างอย่างไร

จากบันทึกที่ผ่านมา ได้นำ CLEM มาเล่าให้ฟังกันไปแล้วนั้น แม้ SEC ไม่มีเครื่องมือให้บริการ Correlative Light and Electron Microscope (CLEM) แต่ SEC มีทั้งเครื่อง Confocal และ SEM ดังนั้นขั้นตอนการเตรียมตัวอย่างจึงน่าสนใจ อาจลองประยุกต์การทดสอบด้วยเครื่องที่มี ซึ่งขั้นตอนการเตรียมตัวอย่างนั้นไม่ยุ่งยากมากนัก ประกอบด้วยขั้นตอนสำคัญดังนี้

 

ตัวอย่าง: HeLa cells หรือเซลล์มะเร็ง เลี้ยงบนแผ่นกระจกปิดสไลด์ (ITO-coated coverslips) (Matthew et al., 2015)

 

I. วิธีการย้อม Endosomes

  1. ย้อมตัวอย่างด้วยสี A488-Tf (25µg/ml in 1%PBS) นาน 30 นาที แล้วล้างออกด้วยฟอสเฟตบัฟเฟอร์ (PBS)
  2. Fixed ด้วย 4% formaldehyde นาน 30 นาที
  3. นำตัวอย่างมาย้อม Nucleus ด้วยสี DAPI นาน 15 นาที
  4. ล้างด้วยน้ำกลั่น 3 ครั้งๆ ละ 5 นาที
  5. นำตัวอย่างมาทำ dehydration ด้วยเอทานอลความเข้มข้น 30%, 50%, 70%, 90% และ 96% ครั้งละ 5 นาที ตามลำดับ
  6. นำเฉพาะแผ่นกระจกตัวอย่างวางลงใน 12-well plate นำไปทำแห้ง โดยเก็บในเดซิกเคเตอร์ (ซิลิกาเจล) นาน 24 ชั่วโมง (เปิดฝา plate ไว้)

 

II. วิธีการย้อม Actin cytoskeleton

  1. นำตัวอย่างมาล้างด้วย PBS 2 ครั้งๆ ละ 5 นาที
  2. Fixed ด้วย 4% formaldehyde นาน 10 นาที แล้วนำไปแช่ใน 0.5%Triton X-100 นาน 1 นาที และล้างออกด้วย PBS ตามลำดับ
  3. ย้อมตัวอย่างด้วย A488-Ph (165 nM in 1%PBS) นาน 30 นาที แล้วล้างด้วย PBS และย้อมต่อด้วย DAPI นาน 15 นาที
  4. ล้างด้วยน้ำกลั่น และทำแห้งตัวอย่างด้วยวิธีเดียวกัน
หมวดหมู่บันทึก: พัฒนางานประจำ
สัญญาอนุญาต: ซีซี: แสดงที่มา-ไม่ใช้เพื่อการค้า-อนุญาตแบบเดียวกัน Cc-by-nc-sa
สร้าง: 06 พฤศจิกายน 2558 13:20 แก้ไข: 06 พฤศจิกายน 2558 13:22 [ แจ้งไม่เหมาะสม ]
ดอกไม้
สมาชิกที่ให้กำลังใจ: Ico24 LUX, Ico24 คนธรรมดา, และ 4 คนอื่น.
สมาชิกที่ให้กำลังใจ
 
Facebook
Twitter
Google

บันทึกอื่นๆ

ความเห็น

ไม่มีความเห็น

ร่วมแสดงความเห็นในหน้านี้

ชื่อ:
อีเมล:
IP แอดเดรส: 34.236.216.93
ข้อความ:  
เรียกเครื่องมือจัดการข้อความ
   
ยกเลิก หรือ